Руководство + По Электрофорезу

Книга представляет собой практическое руководство по капиллярному электрофорезу - новому методу анализа, обладающему высокой разрешающей.

Книга представляет собой практическое руководство по использованию систем ных пользователями систем капиллярного электрофореза «Капель » в.

Научный совет Российской академии наук по хроматографии Руководство по капиллярному электрофорезу Москва 1996 год Книга представляет собой практическое руководство по капиллярному электрофорезу - новому методу анализа, обладающему высокой разрешающей способностью и сочетающему преимущества электрофоретических методов разделения с возможностью автоматизации анализа и простотой количественного расчета, характерного для высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Научный совет Российской академии наук по хроматографии

ПРАКТИЧЕСКОЕ РУКОВОДСТВО ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ СИСТЕМ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ╚КАПЕЛЬ╩

Книга представляет собой практическое руководство по капиллярному электрофорезу - новому методу анализа, обладающему.

Название: Руководство по капиллярному электрофорезу. Автор: Энгельгардт Х. Формат документа: (pdf). Размер: 1624 Кб.

Н.В. Комарова Я.С. Каменцев ПРАКТИЧЕСКОЕ РУКОВОДСТВО ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ СИСТЕМ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ╚КАПЕЛЬ╩ Санкт-Петербург 2008 УДК 615.844.6 ББК 24.46 П69 Оглавление Предисловие ........................................................................................................................ 3 Комарова Н. В., Каменцев Я. С. Практическое руководство по использованию систем капиллярного электрофореза ╚КАПЕЛЬ╩ — СПб.: ООО ╚Веда╩, 2006. — 212 с. Тираж 2000 экз. (доп. тираж) Список принятых терминов и сокращений ..................................................................... 5 Введение............................................................................................................................. 10 Глава 1. Физико-химические основы метода капиллярного электрофореза ........................ 15 Книга представляет собой практическое руководство по использованию систем капиллярного электрофореза ╚Капель╩, первых и единственных серийно выпускаемых в России приборов для реализации различных вариантов современного инструментального метода — капиллярного электрофореза. Материал книги включает физико-химические основы метода, его аналитические возможности, описание аппаратуры. На примере методик, разработанных специалистами фирмы ╚Люмэкс╩, описаны стратегии разработок с указанием методических особенностей и наших практических рекомендаций. Значительное место в руководстве отведено примерам использования метода капиллярного электрофореза в различных областях. Особое внимание уделено вопросам подготовки капилляра и оценке его работоспособности. Книга написана ведущими специалистами по капиллярному электрофорезу науч но-производственной фирмы ╚Люмэкс╩ с привлечением материалов, наработанных пользователями систем капиллярного электрофореза ╚Капель╩ в нашей стране и за рубежом. Книга предназначена, в первую очередь, для инженеров-химиков и лаборантов аналитических лабораторий, только приступающих к изучению или уже использующих в своей ежедневной практике приборы серии ╚Капель╩ и разработанные для них методики. Она может быть полезна также исследователям и специалистам, областью интересов которых являются методы разделения и их применение для анализа объектов окружающей среды, пищевых продуктов, лекарственных препаратов, биопроб и т. д.; а также тем, кто занят поиском новых областей использования метода капиллярного электрофореза. Глава 2. Основные варианты капиллярного электрофореза ................................................ 26 Глава 3. Аппаратура ........................................................................................................... 28 3.1. Общее устройство систем капиллярного электрофореза ................................. 28 3.2. Капилляры ............................................................................................................ 29 3.3. Источники высокого напряжения ...................................................................... 30 3.4. Ввод пробы............................................................................................................. 31 3.5. Детекторы .............................................................................................................. 32 3.6. Системы сбора и обработки данных ................................................................... 35 3.7. Автосемплеры ........................................................................................................ 36 3.8. Системы термостабилизации .............................................................................. 36 Глава 4. Эффективность, чувствительность, разрешение и селективность в капиллярном электрофорезе.................................................................................................................... 37 4.1. Эффективность разделения ................................................................................. 37 4.2. Чувствительность метода ..................................................................................... 38 4.3. Разрешение и селективность разделения ........................................................... 39 Глава 5. Обработка результатов в капиллярном электрофорезе. Качественный и количественный анализ ............................................................................ 44 5.1. Качественный анализ. Характеристики миграции/удерживания .................. 44 5.2. Количественная обработка результатов анализа .............................................. 45 Глава 6. Объекты для анализа методом капиллярного электрофореза. Подготовка пробы. ............................................................................................................. 47 Глава 7. Области применения метода капиллярного электрофореза и примеры использования систем КЭ ╚Капель╩ ........................................................................................................... 50 7.1. Анализ объектов окружающей среды ................................................................. 52 7.2. Комбикормовая промышленность ..................................................................... 68 7.3. Пищевая промышленность ................................................................................. 80 7.4. Ветеринария .........................................................................................................102 7.5. Фармация ..............................................................................................................103 7.6. Клиническая биохимия ......................................................................................116 7.7. Криминалистическая экспертиза...................................................................... 125 7.8. Технологические задачи ......................................................................................135 7.9. Некоторые методические возможности.............................................................145 7.10. Возможности прибора........................................................................................149 Авторы: Н. В. Комарова, Я. С. Каменцев ISBN 5-903297-01-3 ╘ ООО ╚Люмэкс╩, 2006 ╘ ООО ╚Веда╩, 2006 Система капиллярного электрофореза ╚Капель╩ 3 Глава 8. Некоторые аналитические приложения метода капиллярного электрофореза, разработанные фирмой ╚Люмэкс╩ .....................................................................................155 8.1. Анализ ионного состава воды .............................................................................155 8.1.1. Определение неорганических катионов ....................................................155 8.1.2. Определение неорганических анионов .....................................................159 8.1.3. Одновременное определение катионов калия, натрия, магния, кальция и анионов хлорида и сульфата в водных средах с использованием электроинжекционного анализатора ╚Капель-103РЕ╩ ..........................................................................................166 8.2. Анализ безалкогольных, слабоалкогольных и алкогольных напитков (соков, водок, вин и виноматериалов, пива, бренди и др.) ..........................................169 8.2.1. Определение кофеина, аскорбиновой кислоты, консервантов (сорбиновой и бензойной кислот) и подсластителей (сахарина, аспартама и ацесульфама К) .............................................................................................................169 8.2.2. Определение органических кислот ...........................................................172 8.2.3. Определение синтетических красителей ..................................................174 8.3. Анализ гербицидов классов феноксикарбоновых кислот и симметричных триазинов ..........................................................................................................................178 8.4. Анализ кормов, комбикормов, сырья для их производства, премиксов ..........182 8.4.1. Анализ аминокислот ...................................................................................182 8.4.2. Анализ свободных форм водорастворимых витаминов ..........................188 Глава 9. Общие рекомендации по работе с системами капиллярного электрофореза, возможные трудности и пути их преодоления ....................................................................194 9.1. Подготовка капилляра к работе, проверка его кондиционного состояния, хранение, пути восстановления работоспособности, замена .................................... 194 9.2. Подготовка буферных и анализируемых растворов .........................................198 9.3. Возможные трудности при работе с системами капиллярного электрофореза ╚Капель╩ и программами сбора данных, причины и способы устранения ...............198 Приложения А. Хорошая лабораторная практика ........................................................................ 202 Б. Тестирование систем капиллярного электрофореза ╚Капель╩: проверка работоспособности прибора, контроль качества подготовки капилляра ................................................................... 203 В. Ручная промывка капилляра с помощью медицинского шприца ................... 207 Предисловие С начала 80-х годов XX века получил становление и активное развитие новый инструментальный метод, относящийся к комбинированным методам разделения и анализа — капиллярный электрофорез. Фирма ╚Люмэкс╩ с 1996 года является первым и до сих пор единственным производителем серийных систем капиллярного электрофореза в СНГ. Следуя традиции предлагать к прибору методическое обеспечение, первыми были разработаны методики анализа катионного и анионного состава водных объектов. Совершенствуя и наращивая потенциал приборов ╚Капель╩, мы не забывали также о расширении областей применения этого относительно нового в мире и абсолютно нового на тот момент в России инструментального метода анализа. Эта цель достигалась как в лаборатории нашей фирмы, так и за ее пределами: в исследовательских и производственных лабораториях организаций, сделавших ставку на метод КЭ и на выпускаемую нами аппаратуру. Был накоплен достаточно большой материал, позволявший оценить возможности использования капиллярного электрофореза в самых разных областях. Полученные результаты в 2001 году были представлены нами в сборнике ╚Система капиллярного электрофореза. Основы метода. Аппаратура. Примеры использования систем капиллярного электрофореза „Капель-103, -104, -105“╩. За последние пять лет фирма ╚Люмэкс╩ значительно расширила круг пользователей приборов ╚Капель╩, провела модернизацию имеющегося модельного ряда систем капиллярного электрофореза и выпустила новые модификации, в том числе управляемые от компьютера. Нами были усовершенствованы методики анализа ионного состава воды, разработаны новые методики определения (аминокислот, витаминов, органических кислот, красителей и др.), накоплены материалы, демонстрирующие широкие аналитические возможности метода. Безусловно, все эти годы мы поддерживаем тесную связь с нашими коллегами, которые используют приборы ╚Капель╩ для решения рутинных задач по аттестованным методикам, а также для научных и прикладных исследований. При этом мы понимаем, что пользователями ╚Капелей╩ могут быть как начинающие аналитики, так и опытные исследователи, но все они, безусловно, нуждаются в литературе по капиллярному электрофорезу, которой на русском языке все еще непростительно мало. Приступая к написанию этой книги, авторы ставили перед собой 3 цели. Во-первых, нам хотелось в доступной форме дать представление о научных основах капиллярного электрофореза, что послужило бы фундаментом для понимания решаемых с его помощью практических задач. Во-вторых, на конкретных аналитических примерах, в основе которых лежат разработанные фирмой методики, продемонстрировать стратегию разработки каждого из анализов с указанием методических особенностей и наших практических рекомендаций. В-третьих, привести многочисленные (но далеко не все возможные) примеры практического использования метода, реализованные на системах капиллярного электрофореза ╚Капель╩. 4 Фирма аналитического приборостроения ╚Люмэкс╩ Система капиллярного электрофореза ╚Капель╩ 5 Авторы выражают признательность своим коллегам Соломоновой А. П., Ши ряеву А. В., Ивановой И. В., Адамсон В. Г., Морозовой О. В., Гремякову А. И., Лебедеву М. Ю., Шпаку А. В., Окуню В. М. за помощь в подготовке глав 7 и 8. Мы благодарны также Дружихиной В. М. и Родионенко Е.В. за подготовку материалов к печати, Бурлешину А.В. за внимательное прочтение материалов и высказанные замечания. Нам хотелось бы особенно поблагодарить наших коллег из других организаций, любезно предоставивших свои материалы для этого издания, и пожелать им дальнейших успехов в продвижении метода капиллярного электрофореза. Список принятых терминов и сокращений Капиллярный электрофорез, являясь относительно молодым методом разделения и анализа, поначалу заимствовал большую часть терминов из наиболее близкого сепарационного метода — ВЭЖХ. Со временем, учитывая основной принцип разделения в КЭ — электромиграционный, была сформирована собственная терминологическая база метода капиллярного электрофореза, которая с 2002 г. рекомендована к использованию ИЮПАК. В этом разделе мы приведем лишь те основные термины и сокращения, которые будут активно использоваться в данном Практическом руководстве. В связи с тем, что подавляющее большинство публикаций по КЭ продолжает выходить на английском языке, мы приведем наряду с русскими названиями английские общепринятые эквиваленты. Наталья Викторовна Комарова Ярослав Сергеевич Каменцев Термины Время миграции t м (migration time, tm) — время, необходимое компоненту для прохождения им эффективной длины капилляра (L эфф, Leff ) от зоны ввода пробы (начала капилляра) до зоны детектирования. Электроосмотический поток ЭОП (electroosmotic flow, EOF) — течение жидкости в капилляре под действием приложенного электрического поля. Время, необходимое жидкости для преодоления эффективной длины капилляра вследствие возникающего ЭОП, называют временем ЭОП (t эоп, teof) и экспериментально определяют из электрофореграммы (electropherogram) по времени миграции нейтрального компонента — маркера ЭОП. Подвижность ЭОП ╣ эоп (electroosmotic mobility, ╣eof ) — представляет собой отношение скорости ЭОП к напряженности электрического поля. Скорость ЭОП (electroosmotic velocity, veof) положительна при направлении движения жидкости от входного участка капилляра к детектору и отрицательна при обратном направлении. Скорость ЭОП вычисляют как: vэоп = L эфф/t эоп . Напряженность электрического поля представляет собой отношение приложенной разности потенциалов (U ) к общей длине капилляра (L общ, Ltot). Таким образом, подвижность ЭОП вычисляют из экспериментальных данных: ╣ эоп = L общ х L эфф/t эоп хU. Традиционно при расчете подвижностей длину капилляра выражают в сантиметрах, время миграции в секундах, а разность потенциалов в вольтах. Примечание. Время миграции как параметр качественного анализа принято выражать в минутах, однако для скоростных анализов, общее время которых не превышает 2–3 минут, время миграции приводят в секундах. Электрофоретическая подвижность частицы ╣ эф (electrophoretic mobility, ╣ep) — по аналогии с предыдущей величиной представляет собой отношение электрофоретической скорости частицы к напряженности электрического поля и может быть вычислена: ╣ эф = L общ х L эфф/t м хU. В отличие от ╣ эоп электрофоретическую подвижность частицы нельзя определить непосредственно из электрофореграммы, поскольку время миграции частицы t м в 6 Фирма аналитического приборостроения ╚Люмэкс╩ Система капиллярного электрофореза ╚Капель╩ 7 этом случае представляет собой сумму времен миграции собственно частицы и маркера ЭОП. Из эксперимента можно найти так называемую общую подвижность, которая выражается (при положительной скорости ЭОП): ╣ общ = ╣ эоп+╣ эф. Зная из эксперимента ╣ общ и ╣ эоп можно легко рассчитать ╣ эф. Капиллярный электрофорез КЭ (Capillary Electrophoresis, CE) — метод разделения, реализуемый в капиллярах и основанный на различиях в электрофоретических подвижностях заряженных частиц как в водных, так и в неводных буферных электролитах. Буферные растворы (ведущие электролиты, рабочие буферы, background electrolyte, run buffer) могут содержать добавки (например, макроциклы, органические растворители, полимеры и др.), которые способны взаимодействовать с анализируемыми частицами и изменять их электрофоретическую подвижность. Примечание 1. Этот метод известен также как капиллярный зонный электрофорез (Capillary Zone Electrophoresis, CZE). Нейтральные компоненты не могут быть разделены этим методом, все они мигрируют в зоне ЭОП. Примечание 2. Использование термина капиллярный электрофорез в качестве общего термина для всех капиллярных электромиграционных методов не рекомендуется, поскольку многие из этих методов (капиллярный гель-электрофорез, капиллярный аффинный электрофорез, капиллярная изоэлектрическая фокусировка, ка пил лярный изотахофорез, мицеллярная электрокинетическая хроматография, мик роэмульсионная электрокинетическая хроматография, капиллярная электрохроматография) основаны на отличных от КЭ принципах разделения. Мицеллярная электрокинетическая капиллярная хроматография (Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography, MECC) — метод разделения, основанный на комбинации электрофоретического и хроматографического принципов разделения. В состав буферного раствора вводят поверхностно-активное вещество, которое при определенных концентрациях формирует псевдостационарную мицеллярную фазу, и компоненты пробы распределяются между этой фазой и фазой буферного раствора согласно их гидрофобности. Примечание 1. Этот метод также называют мицеллярной электрокинетической хроматографией МЭКХ (Micellar Electrokinetic Chromatography, MEKC). Примечание 2. Время миграции мицеллы (migration time of the micelles, tmc) экспериментально определяют как время миграции компонента, полностью удерживаемого мицеллярной фазой. Маркером мицелл, например, является судан 3. Сокращения Сокращение 2М-4Х 2,4-Д 2,4-ДМ 2,4-ДП 2,4-ДХФ 2,4,5-Т АПАВ АК БИА ВЭЖХ ГК ДДСН ДЭА ДЭС и.э.т. КЗЭ ККМ КПАВ КЭ МВИ МС МЦ МЭКХ ПЗУ ТФЭ ФИТЦ ФКК ФТГ ФТК-производные Полное название 2-метил-4-хлорфеноксиуксусная кислота 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота 2,4-дихлорфеноксимасляная кислота 2,4-дихлорфеноксипропионовая кислота 2,4-дихлорфенол 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота анионное поверхностно-активное вещество аминокислоты бензимидазол высокоэффективная жидкостная хроматография гуминовые кислоты додецилсульфат натрия диэтаноламин двойной электрический слой изоэлектрическая точка капиллярный зонный электрофорез критическая концентрация мицеллообразования катионное поверхностно-активное вещество капиллярный электрофорез методика выполнения измерений масс-спектрометрия макроцикл мицеллярная электрокинетическая хроматография постоянное запоминающее устройство твердофазная экстракция фенилизотиоцианат феноксикарбоновые кислоты фенилтиогидантоин фенилтиокарбамильные производные 8 ФУК ЦД ЦТАБ ЦТАОН ЭДТА ЭОП Ala Arg Asn Asp Cys-Cys D Gln Glu Gly His ID Ile k' L общ L эфф Leu Lys Met N Phe pK a Pro q r Rs Ser Фирма аналитического приборостроения ╚Люмэкс╩ Система капиллярного электрофореза ╚Капель╩ 9 феноксиуксусная кислота циклодекстрин цетилтриметиламмония бромид цетилтриметиламмония гидроксид этилендиаминтетрауксусная кислота (и ее соли) электроосмотический поток аланин аргинин аспарагин аспарагиновая кислота цистин коэффициент диффузии глутамин глутаминовая кислота глицин гистидин внутренний диаметр капилляра изолейцин фактор емкости общая длина капилляра эффективная длина капилляра лейцин лизин метионин эффективность фенилаланин константа диссоциации пролин заряд частицы радиус частицы разрешение соседних пиков серин tм Thr Trp Tyr U Val W1/2 время миграции треонин триптофан тирозин разность потенциалов валин ширина пика на половине высоты фактор селективности межфазная разность потенциалов диэлектрическая константа дзета-потенциал вязкость раствора ╣общ ╣ эоп ╣ эф общая подвижность частицы подвижность электроосмотического потока электрофоретическая подвижность частицы 10 Фирма аналитического приборостроения ╚Люмэкс╩ Система капиллярного электрофореза ╚Капель╩ 11 Введение В последние два десятилетия в мире отмечен активный интерес к новому, интенсивно развивающемуся методу разделения сложных смесей — капиллярному электрофорезу, позволяющему анализировать ионные и нейтральные компоненты различной природы с высокой экспрессностью и уникальной эффективностью. В основе капиллярного электрофореза лежат электрокинетические явления — электромиграция ионов и других заряженных частиц и электроосмос. Эти явления возникают в растворах при помещении их в электрическое поле, преимущественно, высокого напряжения. Если раствор находится в тонком капилляре, например, в кварцевом, то электрическое поле, наложенное вдоль капилляра, вызывает в нем движение заряженных частиц и пассивный поток жидкости, в результате чего проба разделяется на индивидуальные компоненты, так как параметры электромиграции специфичны для каждого сорта заряженных частиц. В то же время, такие возмущающие факторы, как диффузионные, сорбционные, конвекционные, гравитационные и т. п., в капилляре существенно ослаблены, благодаря чему достигаются рекордные эффективности разделений. Традиционно капиллярный электрофорез сравнивают с высокоэффективной жид костной хроматографией (ВЭЖХ), поскольку в обоих методах разделение происходит в ограниченном пространстве (капилляре или колонке) с участием движущейся жидкой фазы (буферного раствора или подвижной фазы (элюента)) и для регистрации сигналов используют схожие принципы детектирования и программы обработки данных. Тем не менее у методов есть отличия, которые, безусловно, относятся к достоинствам капиллярного электрофореза: ⌠ высокая эффективность разделения (сотни тысяч теоретических тарелок), недоступная ВЭЖХ и связанная с плоским профилем ЭОП, ⌠ малый объем анализируемой пробы и буферов (не более 1–2 мл в день), при этом практически не требуется применение высокочистых, дорогостоящих органических растворителей, ⌠ отсутствие колонки, сорбента, проблем с его старением и, значит, заменой колонки, ⌠ простая и недорогая аппаратура, ⌠ экспрессность и низкая себестоимость единичного анализа. Из ограничений КЭ следует отметить невысокую, по сравнению с ВЭЖХ, концентрационную чувствительность и требование к анализируемым соединениям растворяться в воде и разбавленных водно-органических смесях. В то же время эти ограничения не являются непреодолимыми. Так, недостаточную чувствительность определения при использовании УФ-детектирования (из-за малой длины оптического пути, равного внутреннему диаметру капилляра) может скомпенсировать использование таких видов детектирования, как лазерно-индуцированное флуориметрическое или масс-спектрометрическое в сочетании с различными приемами on-line концентрирования пробы (т. н. стэкинг и свиппинг). А вариант неводного капиллярного электрофореза успешно позволяет разделять и анализировать сильно гидрофобные, нерастворимые в водных растворах компоненты пробы. Метод капиллярного электрофореза сегодня с успехом применяется для анализа разнообразных веществ (неорганических и органических катионов и анионов, аминокислот, витаминов, наркотиков, красителей, белков и т. д.) и объектов (для контроля качества вод и напитков, технологического контроля производства, входного контроля сырья, анализа фармпрепаратов и пищевых продуктов, в криминалистике, медицине, биохимии и т. д.). В России работы, связанные с изучением возможностей метода КЭ и его аналитических приложений, стали появляться лишь в последние годы, что в существенной степени инициировалось созданием отечественных приборов для капиллярного электрофореза. Системы капиллярного электрофореза ╚Капель╩, разработанные и выпускаемые фирмой ╚Люмэкс╩, являются первым в России и СНГ серийным семейством приборов, внесенных в Госреестр средств измерений и предназначенных для реализации этого метода. В состав семейства на сегодняшний день входят следующие модификации, аттестованные как средства измерения: ╚Капель-103Р╩, ╚Капель-103РТ╩, ╚Капель-104Т╩, ╚Капель-104М╩, ╚Капель-105╩ и ╚Капель-105М╩. Фирма выпускает также опытные модификации — электроинжекционные анализаторы ╚Капель-РЕ╩. Разрабатываются модели с встроенным блоком измерения потенциала течения ╚Капель-ПТ╩. Системы капиллярного электрофореза ╚Капель╩ предназначены для количественного и качественного определения состава проб веществ в водных и водно-органических растворах методом капиллярного электрофореза. На приборах любой из модификаций без ограничений могут быть реализованы методики, использующие основные варианты КЭ — капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) или мицеллярную электрокинетическую хроматографию (МЭКХ). Первый вариант предназначен для анализа только ионных компонентов проб, второй — для анализа как ионных соединений, так и молекулярных форм веществ. Разнообразие технических решений, использованных специалистами фирмы ╚Люмэкс╩ при создании приборов семейства ╚Капель╩, табл. 1, позволяет потребителю выбрать ту систему, которая в наибольшей степени соответствует характеру решаемой задачи. 12 Фирма аналитического приборостроения ╚Люмэкс╩ Система капиллярного электрофореза ╚Капель╩ 13 ╚Капель-103Р╩ наиболее простая модель с ручным управлением и пошаговым прин ципом работы. В прибор можно установить только одну пробирку с анализируемым раствором. ╚Капель-103Р╩ идеально подходит для обучения методу капиллярного электрофореза в университетах, технических лицеях и лабораториях благодаря наглядности всех процедур и простоте управления. ╚Капель-103РТ╩ отличается от предыдущей модели наличием жидкостной системы охлаждения капилляра, которая позволяет поддерживать температуру теплоносителя на заданном уровне независимо от температуры лабораторного помещения, благодаря чему повышается воспроизводимость результатов измерения. Эффективное охлаждение капилляра позволяет использовать для анализа более высокие напряжения, что влечет за собой возрастание эффективности разделения и уменьшение времени анализа. ╚Капель-104Т╩ предназначена для выполнения серийных анализов. Она снабжена двумя автосемплерами, системой жидкостного охлаждения капилляра, имеет удобный интерфейс, позволяющий создавать программы работы прибора в автоматическом режиме. Более простая модель ╚Капель-104╩ (с воздушным, менее эффективным охлаждением капилляра) в настоящее время снята с производства. ╚Капель-104М╩, сохраняя все возможности ╚Капели-104Т╩, имеет самую современную на сегодня электронику, полностью управляется от компьютера, снабжена единой программой управления, сбора и обработки электрофоретических данных. Усовершенствованная конструкция кассеты с капилляром позволяет быстро и надежно проводить замену капилляра. ╚Капель-105╩ — прибор с наиболее широкими возможностями. В нем сохранены наилучшие качества предыдущих моделей — жидкостная система охлаждения капилляра, автосемплеры, возможность работы в программируемом автоматическом режиме. В дополнение к этому прибор имеет спектрофотометрический детектор на основе дейтериевой лампы и монохроматора с дифракционной решеткой, благодаря чему рабочий диапазон длин волн охватывает область от 190 до 400 нм. Всё это делает ╚Капель-105╩ незаменимым прибором для исследовательской работы как в области разработки новых методик, так и в аналитической практике. Самой последней из аттестованных моделей в серии ╚Капель╩ на сегодняшний день является ╚Капель-105М╩. В ней наряду с новейшей электронной базой реализованы полное управление прибором, сбор и обработка данных с помощью собственного программного обеспечения, а также возможность регистрации спектров поглощения компонентов анализируемой пробы во время анализа. Опытные модификации ╚Капель-РЕ╩ представляют собой электроинжекционные анализаторы — приборы для реализации нового метода капиллярного электрофореза. В этом методе электрокинетическим способом в капилляр с двух концов вводят компоненты, которые способны взаимодействовать друг с другом. Встречаясь в капилляре эти компоненты образуют новые соединения, которые обладают иной подвижностью, чем исходные, и, следовательно, могут быть зарегистрированы при прохождении через зону детектирования. Прибор может быть интересен тем, кто занимается проблемами химической кинетики, реакционной способности, комплек- Таблица 1. Технические характеристики приборов серии ╚Капель╩. Характеристики фотометрический детектор высоковольтный блок ввод пробы смена проб промывка капилляр Капель╝-103Р Капель╝-103РТ 254 нм Капель╝-104Т Капель╝-105 Капель╝-105М 190–380 нм постоянное напряжение 1–25 кВ, с шагом 1 кВ, сменная полярность, ток 0–200 мкА гидродинамический или электрокинетический ручная автоматическая с двумя автосемплерами на 10 входных и 10 выходных пробирок при постоянном давлении ~1000 мбар кварцевый (длина 30–100 см, внутренний диаметр 50 или 75 мкм) принудительное воздушное жидкостное с заданием и контролем температуры теплоносителя (диапазон от –10 до +30 ╟С от температуры окружающей среды) время анализа давление температура напряжение 187–242 В, 50/60 Гц 80 420x 330 x360 16 420 x350 x 360 150 500 x500 x500 25 30 (105М) 200 время анализа длина волны давление температура напряжение охлаждение капилляра возможность задания и/или изменения параметров в ходе анализа питание потребляемая мощность, Вт габариты, мм масса, кг время анализа давление напряжение Сбор, обработку и вывод данных осуществляется с помощью персонального компьютера с операционной системой ╚Windows╝ 98/ME/NT/2000/XP╩, на котором установлена программа сбора и обработки хроматографических данных ╚МультиХром╝ для Windows╝╩, версия 1,5х. Для модификаций ╚КАПЕЛЬ╝-105М/104М╩ управление прибором, сбор и обработка данных осуществляется с помощью ПО ╚Эльфоран╝╩. Для модификации ╚КАПЕЛЬ╝-105М╩ управление прибором, сбор и обработка данных возможны с помощью ПО ╚МультиХром╝ для Windows╝╩, версия 2,5х. 14 Фирма аналитического приборостроения ╚Люмэкс╩ Глава 1. Физико-химические основы метода капиллярного электрофореза 15 сообразования и т. п. Особенностью прибора является специальная кассета, в которой окно детектора расположено в середине капилляра, благодаря чему эффективная длина капилляра одинакова как для катионных, так и для анионных компонентов проб. Кроме ртутной лампы прибор снабжен сменной лампой накаливания и набором светофильтров, которые позволяют расширить рабочий диапазон длин волн на видимую и ближнюю инфракрасную область спектра. Модификация ╚Капель-ПТ╩ оборудована блоком измерения потенциала течения. Потенциал течения (в англ. литературе — streaming potential), по физической сущности — явление обратное электроосмотическому потоку, возникает на концах капилляра, когда в нём создается поток электролита. Он возникает и при промывке капилляра ведущим буферным раствором при кондиционировании капилляра. Измерение потенциала течения (ПТ) в этот момент позволяет оценить степень готовности капилляра к очередному анализу, и, тем самым, повысить воспроизводимость времени выхода компонентов в серии однотипных электрофореграмм. В свою очередь улучшение воспроизводимости времён выхода сопровождается улучшением воспроизводимости количества вещества в пике, т. е. воспроизводимости количественной оценки концентрации вещества в пробе. В любой модели системы ╚Капель╩ можно задавать или изменять в ходе анализа: давление, напряжение, время анализа, температуру (для систем с жидкостным охлаждением капилляра), длину волны (для моделей 105/105М). Таким образом, широкие возможности метода в сочетании с многофункциональностью аппаратурного оформления позволяют использовать капиллярный электрофорез и приборы ╚Капель╩ для решения самых разнообразных аналитических задач. Глава 1. Физико-химические основы метода капиллярного электрофореза Движение заряженных коллоидных частиц под действием внешнего электрического поля носит название электрофореза. Электрофорез как метод разделения предложен в 30-х годах XX в. Тизелиусом. Он поместил смесь белков сыворотки крови в буферный раствор и при наложении электрического поля обнаружил, что компоненты пробы мигрируют в направлении и со скоростью, определяемыми их размером, формой и электрическим зарядом. В 1948 г. работа была удостоена Нобелевской премии по химии. Главным ограничением широкого использования метода была низкая эффективность разделения из-за тепловых эффектов и конвекции жидкости. Эта проблема была частично решена благодаря использованию неконвективной среды (полиакриламидные гели) в гель-электрофорезе. Несмотря на то, что разделение в геле довольно широко распространено, особенно в биохимии, очевидны и его ограничения: длительное время анализа, недостаточная эффективность, трудности при детектировании и автоматизации. В 1967 г. шведский ученый Хиртен предложил проводить электрофоретическое разделение не на плоскости, а в открытых трубках — капиллярах с внутренним диаметром 1–5 мм, тем самым положив начало методу капиллярного электрофореза. Позже Виртанен и Миккерс использовали стеклянные и тефлоновые капилляры с внутренним диаметром 200 мкм, и, наконец, в начале 80-х гг. XX в. Йоргенсон и Лукас продемонстрировали сепарационные возможности кварцевого капилляра с внутренним диаметром 75 мкм, использовав последние достижения в изготовлении кварцевых капилляров очень малых и равномерных внутренних диаметров (~ десятки мкм), прозрачных в ультрафиолетовой области спектра. Кроме того, в мире был уже накоплен значительный опыт по возможностям детектирования аналитических сигналов в потоке. С этого момента начинается активное развитие метода капиллярного электрофореза в его современном формате, продолжающееся по настоящее время. Метод КЭ основан на разделении заряженных компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля. Микрообъем анализируемого раствора (~2 нл) вводят в кварцевый капилляр, предварительно заполненный подходящим буфером — электролитом. После подачи высокого напряжения (до 30 кВ) к концам капилляра компоненты смеси начинают двигаться с разной скоростью, зависящей, в первую очередь, от заряда и массы (точнее, величины ионного радиуса) и, соответственно, в разное время достигают зоны детектирования. Полученная последовательность пиков называется электрофореграммой; качественной характеристикой вещества является время миграции, а количественной — высота или площадь пика, пропорциональная концентрации вещества. Для того чтобы получить более подробное представление о методе, необходимо рассмотреть ряд процессов, происходящих в капилляре, заполненном электролитом и помещенном в продольное электрическое поле. Находящиеся на поверхности плавленного кварца силоксановые группы при контакте с водой или водными растворами гидролизуются с образованием удвоенного количества силанольных групп, которые затем гидратируются. >Si=O Н 2О ОН >Si ОН 16 Система капиллярного электрофореза ╚Капель╩ Глава 1. Физико-химические основы метода капиллярного электрофореза 17 Скорость и степень гидролиза зависят от температуры и рН водных растворов и, в меньшей степени, от концентрации солевого фона раствора. В водном растворе силанольные группы способны к кислотной диссоциации. Константа первой ступени имеет величину К а1 = 2,5x10 -3. Это означает, что при рН водного раствора больше 2,5 поверхность кварца приобретает некоторый отрицательный заряд, который возрастает при увеличении рН раствора. Наоборот, при рН ~2 и меньше диссоциация силанольных групп практически полностью подавлена, и поверхность кварца становится нейтральной. Диссоциация силанольных групп вызывает на границе раздела кварц–водный раствор электролита образование двойного электрического слоя (ДЭС), рис. 1а. Первую его обкладку составляют неподвижные отрицательно заряженные силанольные группы. Вторую обкладку двойного слоя составляют положительно заряженные катионы, существующие в растворе. Диэлектриком, разделяющим обкладки этого конденсатора, являются молекулы воды, гидратирующие как силанольные группы, так и катионы. Положительная часть ДЭС, в свою очередь, делится на две части: первую (или неподвижную), непосредственно примыкающую к поверхности кварца, и вторую (или диффузную), располагающуюся на некотором удалении от поверхности. В неподвижной части количество положительных зарядов меньше, чем отрицательных зарядов на поверхности кварца из-за увеличения размеров катионов вследствие гидратации. В результате в диффузной части ДЭС образуется некоторая избыточная концентрация катионов. Между этими двумя слоями проходит т. н. граница скольжения — при наложении вдоль капилляра электрического поля неподвижная часть остается на месте, в то время как диффузная часть начинает мигрировать к катоду, увлекая за собой в силу межмолекулярного сцепления всю массу жидкости в капилляре. Возникает электроосмотический поток (ЭОП), который осуществляет пассивный перенос раствора внутри капилляра. Скорость ЭОП в сильной степени зависит от рН раствора: в сильнокислых растворах ЭОП отсутствует, в слабокислых — его скорость незначительна, а при переходе в нейтральную и щелочную область рН скорость ЭОП возрастает до максимально возможной. С другой стороны, эта величина зависит от концентрации электролита в ведущем буфере: чем она больше, тем выше становится доля катионов в неподвижной части ДЭС, а толщина диффузной части уменьшается и, соответственно, уменьшается скорость электроосмотического потока. На рис. 1б показано распределение зарядов в ДЭС. Общий потенциал ( ), создаваемый диссоциированными силанольными группами, пропорционален заряду. Часть этого потенциала ( ) нейтрализуется положительными зарядами ионов неподвижной части второй обкладки двойного слоя. Остальная часть положительных зарядов создает в приповерхностном слое раствора электрокинетический или -потенциал (дзета-потенциал). Рис. 1а. Строение двойного электрического слоя. Толщина диффузной части ДЭС Рис. 1б. Распределение зарядов в ДЭС. 18 Система капиллярного электрофореза ╚Капель╩ Глава 1. Физико-химические основы метода капиллярного электрофореза 19 Уникальное свойство ЭОП заключается в плоском профиле потока (в отличие от параболического в ВЭЖХ), который при движении зон компонентов внутри капилляра практически не вызывает их уширения ( рис. 2). Благодаря этому метод КЭ характеризуется высочайшей эффективностью (~ сотни тысяч теоретических тарелок). Электроосмотический поток В приборах для капиллярного электрофореза капилляр, заполненный раствором электролита, своими концами опущен в два содержащих тот же электролит сосуда, в которые введены электроды. Электролит должен обладать буферными свойствами, чтобы, с одной стороны, воспрепятствовать изменению состава раствора в приэлектродных пространствах, а с другой — стабилизировать состояние компонентов пробы в процессе анализа. При подаче на электроды высокого напряжения в капилляре быстро устанавливается стационарное состояние: через капилляр протекает постоянный электроосмотический поток, на который накладывается взаимно противоположная электромиграция катионов и анионов. Если в капилляр со стороны анода ввести небольшой объем раствора пробы, то ЭОП будет переносить эту зону к катоду (в область детектирования), и зона некоторое время сможет находиться в капилляре под воздействием электрического поля высокого напряжения. В течение этого времени заряженные компоненты пробы будут перемещаться в соответствии с их электрофоретическими подвижностями. Катионные компоненты пробы, двигаясь к катоду, будут обгонять электроосмотический поток ( рис. 3). Скорость их движения складывается из скорости ЭОП и скорости электромиграции, поэтому на выходе капилляра катионы появляются первыми и тем раньше, чем больше их электрофоретическая подвижность. Нейтральные компоненты пробы способны перемещаться только под действием электроосмотического потока, тогда как анионные будут перемещаться к аноду со скоростями меньшими, чем скорость ЭОП. Медленно мигрирующие анионы появятся на выходе после ЭОП, а те, чья скорость электромиграции по абсолютной величине превышает скорость ЭОП, будут выходить из капилляра в прианодное пространство. Ламинарный поток Рис. 2. Влияние профиля потока на ширину зоны вещества. 20 Система капиллярного электрофореза ╚Капель╩ Глава 1. Физико-химические основы метода капиллярного электрофореза 21 Если время нахождения пробы в капилляре (которое можно регулировать изменением напряжения, величины рН и концентрации ведущего электролита) достаточно, чтобы проявились различия в подвижности ионов, то на выходе капилляра вблизи катода можно наблюдать зоны раствора, в которых находятся индивидуальные компоненты пробы. Ведущий электролит (его называют также рабочим буферным раствором) должен иметь такую концентрацию, при которой электрическое сопротивление раствора в капилляре будет достаточно велико. Это требование связано с тем, что при прохождении электрического тока в проводнике выделяется тепло. Если ток достаточно велик, то жидкость в капилляре может даже закипеть. Традиционно считается, что электрический ток в капилляре подчиняется закону Ома, хотя известно, что линейная связь тока и напряжения существует в растворе только в ограниченном диапазоне напряжений. Рассмотрим некоторые аспекты этого явления на конкретном примере. Пусть полная длина капилляра равна 60 см, эффективная длина (т. е. длина от входа до окна детектора) — 50 см, рабочее напряжение, поданное на электроды, равно 25 кВ, сила тока в капилляре составляет 100 мкА. Сила тока в капилляре зависит от его длины и диаметра, а также от концентрации электролита в растворе. Для капилляра с внутренним диаметром 75 мкм сила тока 100 мкА при напряжении 25 кВ достигается при концентрации соли в электролите 0,03–0,04 моль/л. В выбранных условиях электрическое сопротивление цепи составляет 250 М (мегаОм), градиент напряжения, который практически совпадает с градиентом поля, составляет 416 В/см. Мощность, выделяющаяся в капилляре, в этом случае равна 2,5 Вт. Так как вся она превращается в тепловую энергию, её удобнее пересчитать в тепловые единицы — калории. Пересчет показывает, что в капилляре ежесекундно выделяется 0,6 калории — гигантское количество, если учесть, что объём жидкости в капилляре диаметром 75 мкм составляет всего 2,65 мкл. Если не принимать в расчет перенос тепла через стенку капилляра, то такого количества достаточно, чтобы в течение 1 секунды температура жидкости в капилляре возросла на 225 ╟С (!). Этот формальный расчет показывает, насколько серьёзна проблема охлаждения капилляра в КЭ. В действительности выделяющаяся теплота расходуется не только на нагревание раствора, но также на нагрев кварцевых стенок и полиимидной оболочки. Нужно также учесть, что теплоёмкость кварца в ~6 раз меньше, чем водного раствора, а теплопроводность плавленого кварца в 16 раз больше, чем у воды. Все эти обстоятельства способствуют эффективному отводу тепла во внешнюю среду, однако, если не принять специальных мер, жидкость в капилляре очень скоро закипит. Поэтому в приборах для КЭ всегда присутствуют либо системы охлаждения капилляра энергичным воздушным обдувом, либо системы жидкостного охлаждения. Тепловое равновесие в капилляре устанавливается достаточно быстро. Оно характеризуется сравнительно малым различием температуры раствора в радиальном направлении во внутреннем канале капилляра и устойчивым градиентом температур между внутренней и внешней стенками капилляра. Нагрев жидкости не вызывает появления конвективных потоков, так как нагревание происходит равномерно по всему просвету капилляра. В результате не происходит перемешивание жидкости, приводящее к размыванию зон определяемых компонентов. При чрезмерном нагреве возможно закипание жидкости, и пузыри пара прерывают ток в капилляре, что дела- Рис. 3. Электрофоретическая миграция ионов в присутствии электроосмотического потока. 22 Система капиллярного электрофореза ╚Капель╩ Глава 1. Физико-химические основы метода капиллярного электрофореза 23 ет анализ невозможным. Поэтому при выборе условий электрофоретического разделения следует стремиться к минимизации тока соответствующим выбором концентрации ведущего электролита. В зависимости от концентрации электролитов в растворах буфера и пробы поведение компонентов при разделении может несколько различаться. Если электропроводности ведущего электролита и пробы одинаковы, то падение напряжения на всей длине капилляра равномерно, и компоненты пробы равномерно перемещаются каждый с присущей ему скоростью. В этом случае на выходе капилляра (точнее, в зоне окна детектора) ширина пика будет приблизительно равна ширине зоны пробы (если пренебречь размыванием). Следовательно, эффективное разделение может быть достигнуто при введении возможно меньшего объема пробы (но для обеспечения необходимой чувствительности концентрация определяемых компонентов в пробе должна быть возможно выше). Иное поведение наблюдается в случае, если электропроводность раствора пробы меньше электропроводности ведущего электролита. В этом случае в капилляре появляется участок с высоким сопротивлением и сила тока через капилляр уменьшается, но в соответствии с законом Ома падение напряжения на участке, занятом пробой, возрастает во столько раз, во сколько раз сопротивление пробы больше, чем сопротивление равного участка ведущего электролита. Таким образом, если сопротивление раствора пробы в капилляре будет в 10 раз больше, чем сопротивление ведущего электролита, градиент потенциала в зоне пробы будет в 10 раз выше, чем в остальной части капилляра. Высокий градиент потенциала в зоне пробы заставляет компоненты пробы быстрее мигрировать к границе зоны, где они в сконцентрированном и предварительно разделенном виде переходят в ведущий электролит, и там продолжают, но уже медленнее, движение к детектору. Описанное явление носит название стекинга и широко используется в практике электрофоретичесих разделений. Оно позволяет получать очень узкие пики определяемых компонентов и, как следствие, концентрация их в пике оказывается значительно выше, чем в исходной пробе. Практически стекинг осуществляют таким образом, что перед вводом пробу разбавляют специальным буферным раствором (концентрация которого в 10 раз меньше, чем концентрация рабочего буферного раствора) или даже дистиллированной водой. В том же случае, когда электропроводность раствора пробы больше, чем электропроводность ведущего электролита, падение напряжения на участке, занятом пробой, резко уменьшается. В результате скорость электромиграции компонентов пробы уменьшается, они медленнее достигают границы зоны, а при переходе в ведущий электролит скорость их движения увеличивается. Происходит размазывание пиков, они накладываются друг на друга, эффективность разделения резко ухудшается. В методе капиллярного электрофореза применяются открытые системы в том смысле, что раствор электролита, в котором происходит разделение, не отделен от электродов, на которые подается напряжение, хотя приэлектродные пространства соединяются через тонкий кварцевый капилляр, выполняющий основную разделяющую функцию, но также служащий электролитическим мостиком, замыкающим электрическую цепь. В электрических цепях, содержащих одновременно проводники первого и второго рода, протекание тока невозможно без электрохимических реакций на границах металл–раствор. В капиллярном электрофорезе стараются ис- пользовать такие составы буферных ведущих электролитов, в которых на электродах происходит разложение воды (одним из самых распространенных буферов для КЭ является раствор буры). На катоде происходит восстановление ионов водорода, выделение на поверхности катода молекулярного водорода и образование в прикатодном пространстве гидроксильных ионов. На аноде — окисление гидроксильных ионов, выделение на поверхности анода молекулярного кислорода и образование в прианодном пространстве ионов водорода. На катоде: На аноде: 2H2O + 2e2ΟΗ− – 2eΗ2 + 2ΟΗ− Ο2 + 2Η+ При высоких разностях потенциалов, которые применяются в КЭ, на электродах могут протекать и другие параллельные электрохимические реакции, но приведённые выше являются основными. Образующиеся и гидроксильные и водородные ионы нейтрализуются буферными компонентами ведущего электролита: при использовании боратного буфера в прикатодном слое борной кислотой, в прианодном — борат-ионом. Таким образом, в приэлектродных пространствах происходит лишь изменение мольного соотношения компонентов буферной смеси, приводящее лишь к незначительному изменению рН раствора. На рис. 4 показано типичное расположение капилляра и электрода в пробирке с раствором электролита, принятое в системах ╚Капель╩. Рис. 4. Типичное расположение капилляра и электрода в пробирке с раствором. 24 Система капиллярного электрофореза ╚Капель╩ Глава 1. Физико-химические основы метода капиллярного электрофореза 25 Устье капилляра располагается в нижней трети объёма пробирки; нижний срез электрода находится приблизительно на нижнем уровне верхней трети раствора. При таком расположении продукты электрохимических реакций, в частности, пузырьки газов, не могут проникнуть в просвет капилляра, также как и раствор ведущего электролита, содержащий продукты нейтрализации и отличающийся по составу от первоначального. В то же время расход ведущего электролита вследствие ЭОП происходит за счет неизменённого раствора из средней трети объёма. Сохранению описанного состояния способствует отсутствие перемешивания раствора в процессе анализа. Предположим, что анализ проходит при токе 100 мкА в течение 15 минут. За это время через раствор пройдет 1x10 -4А x900 сек = 0,09 кулона электричества, что эквивалентно 9,33x10 -7 моля. Такое же количество молей ионов водорода и гидроксила образуется в пробирках, в которых находится по 500 мкл буферного раствора. Следовательно, в течение одного анализа концентрация одного из компонентов буферного раствора изменится на 9,33x10 -7/5x10 -4 = 1,86x10 -3 моль/л. Если исходная общая концентрация компонентов буферного раствора составляет ~0,02 М, то за 5–6 анализов буферная емкость ведущего электролита будет исчерпана полностью. Приведенный пример показывает, что при анализе существенно меняются концентрации компонентов ведущего электролита. Следовательно, для получения воспроизводимых результатов необходимо регулярно, в среднем через каждые 3–4 анализа, заменять свежими порциями растворы ведущего электролита в рабочих пробирках. Это тем более важно, что в прикатодном пространстве накапливаются катионные компоненты проб, которые могут восстанавливаться на катоде до элементного состояния при последующих анализах. Равным образом в прианодном пространстве могут накапливаться анионные компоненты проб. Одним из самых неприятных из них является анион Сl–, который, окисляясь на электроде до свободного хлора, вызывает коррозию платинового анода. Применительно к капиллярному электрофорезу физическая картина происходящих процессов выглядит следующим образом. Наложение потенциала на электроды системы вызывает образование в непосредственной близости от поверхности электродов двойного электрического слоя. Градиенты потенциала на границах приэлектродных двойных слоев превышают потенциал разложения воды, и на электродах начинаются электрохимические реакции. На катоде происходит восстановление ионов водорода, а на аноде — окисление ионов гидроксила. Восстановление одного иона водорода на катоде сопровождается образованием в прикатодном слое одного иона гидроксила, а окисление одного иона гидроксила на аноде сопровождается образованием в прианодном слое одного иона водорода. Эти два элементарных акта электрохимических реакций на электродах эквивалентны переходу через раствор одного электрона. Образовавшиеся в результате электродных реакций ионы являются избыточными — они нарушают материальный и электрический баланс в приэлектродных слоях. Эти ионы отторгаются противоположно заряженной поверхностью электродов, и быстро, практически не покидая приэлектродные слои, нейтрализуются буферными компонентами ведущего электролита — в прикатодной зоне кислотным компонентом, а в прианодной зоне основным компонентом. При том расположении капилляра и электродов, которое описано выше, изменение кислотно-основного баланса будет происходить только в верхних слоях резервуаров. Нарушение стехиометрии растворов, т. е. образование в приэлектродных слоях избыточных концентраций катионов (в прианодном) и анионов (в прикатодном), а также нарушение электри- ческого баланса в приэлектродных слоях вызывают электромиграцию избыточных ионов ведущего электролита во взаимно противоположных направлениях. Внутри капилляра к этим потокам избыточных ионов присоединяется миграция избыточной концентрации катионов диффузной части двойного слоя капилляра. Механизм перемещения носит, по-видимому, эстафетный характер. Каждый элементарный акт электродных реакций заставляет всю массу ионов в растворе переместится на величину межионного расстояния в растворе. Скорость перемещения такова, что во всём объёме капилляра в любой его точке и в любой момент времени соблюдается электронейтральность раствора. Таким образом, роль этих потоков состоит в выравнивании стехиометрических нарушений, имеющих место в приэлектродных пространствах. Факторами, ограничивающими и регулирующими скорость электромиграции, являются электрохимические реакции у поверхности электродов. Поступление катионов в прикатодное пространство стехиометрически компенсируется, электрохимической реакцией, в результате которой некоторое количество катионов восстанавливается до молекулярного состояния и образуется эквивалентное количество анионов, которые в свою очередь компенсируют убыль анионов из прикатодного пространства. В прианодном пространстве в то же время и в том же количестве осуществляется электрохимическая реакция окисления анионов и образование эквивалентного количества катионов. Если в капилляр введена проба, то она потоком жидкости переносится к детектору. Те ионы, которые отличаются от ионов ведущего электролита, мигрируют под действием электрического поля во взаимно противоположных направлениях, причем скорости миграции будут специфичны для каждого сорта ионов. 26 Система капиллярного электрофореза ╚Капель╩ Глава 2. Основные варианты капиллярного электрофореза 27 Глава 2. Основные варианты капиллярного электрофореза Мы уже упоминали выше, что наиболее распространенными вариантами метода капиллярного электрофореза являются капиллярный зонный электрофорез и мицеллярная электрокинетическая хроматография. Самым простым вариантом КЭ является капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ). Компоненты сложной смеси движутся в среде электролита с разными скоростями, образуя дискретные зоны. Отличительная особенность КЗЭ состоит в том, что он пригоден для разделения только ионогенных компонентов пробы, тогда как нейтральные соединения, не обладающие собственной электрофоретической подвижностью, движутся со скоростью ЭОП и выходят в зоне нейтральных компонентов, зоне маркера ЭОП. В приборах капиллярного электрофореза, в которых используется кварцевый капилляр, полярность входного конца чаще всего положительная (анод), и ЭОП переносит зону пробы к катоду. Вблизи катодного выхода установлен детектор. При этих условиях катионные компоненты пробы, тоже мигрируя к катоду, обгоняют ЭОП и первыми достигают детектора в виде отдельных зон, которые на электрофореграмме регистрируются индивидуальными пиками. Через некоторое время детектора достигает и зона исходного раствора, в которой остались нейтральные компоненты пробы. В зависимости от того, поглощают они или нет, на электрофореграмме регистрируется прямой (в некоторых случаях обратный) пик, который часто называют системным. Иногда для идентификации системного пика в пробу добавляют специальные вещества — маркеры ЭОП, например, бензиловый спирт. Что касается анионных компонентов пробы, то их поведение зависит от соотношения скоростей ЭОП и электромиграции анионов. Если скорость миграции аниона превышает скорость ЭОП, то такой анион рано или поздно выйдет из капилляра в прианодное пространство (это нежелательно, т. к. некоторые анионы, например хлорид, попадая в рабочий буферный раствор, будут, разряжаясь на аноде, вызывать коррозию платинового электрода). Если же скорость электромиграции аниона меньше скорости ЭОП, то такой анион может быть зарегистрирован на той же электрофореграмме после выхода системного пика. В этом варианте КЗЭ с положительной полярностью могут определяться катионные компоненты проб и большинство органических анионов. Чтобы методом КЗЭ можно было определять анионные компоненты проб (в основном, неорганического происхождения) необходимо изменить полярность прикладываемого напряжения. Однако в этом случае изменится не только направление миграции анионов, но также направление ЭОП. Для преодоления этого противоречия необходимо модифицировать поверхность кварцевого капилляра так, чтобы знаки зарядов двойного электрического слоя поменялись на обратные. Это достигается введением в рабочий буферный раствор катионного поверхностно-активного вещества, например, бромида цетилтриметиламмония (ЦТАБ). Катион ЦТА+ активно сорбируется на кварцевой поверхности, занимая при достаточной его концентрации все вакансии в ближайшем к поверхности слое. Поверхность как бы ╚ощетинивается╩ длинными цетильными (С16Н33—) цепочками. Ставшая гидрофобной поверхность при дальнейшей промывке рабочим буферным раствором сорбирует еще один слой поверхностно-активного катиона, ориентированного аммонийным концом наружу (сорбция ╚щетка в щетку╩). В результате первый слой двойного электрического слоя становится положительным, а второй, в том числе и диффузная его часть, — отрицательным, и ЭОП снова движется от входного конца к детектору, несколько отставая от мигрирующих быстрее анионов. Несмотря на то, что в последние годы вернулось первоначальное, предложенное Хиртеном более корректное название электрофорез в свободном растворе, подавляющая часть публикаций в области КЭ продолжает использовать традиционное название — ╚капиллярный зонный электрофорез╩. Основным достоинством КЗЭ является высокая эффективность (сотни тысяч теоретических тарелок), при этом селективность, определяемая механизмом разделения внутри одной фазы, в КЗЭ недостаточна. Повышение селективности может быть достигнуто за счет изменения рН ведущего электролита, введения в состав буфера различных добавок: поверхностно-активных веществ, макроциклов, органических растворителей и т. д. Мицеллярная электрокинетическая хроматография объединяет электрофорез и хроматографию. Введенная в 1984 г. японским ученым Терабе, МЭКХ получила наиболее широкое распространение среди других вариантов капиллярного электрофореза, в первую очередь, за счет способности разделять как ионогенные, так и незаряженные компоненты пробы. Разделение нейтральных соединений стало возможным благодаря введению в состав ведущего электролита поверхностно-активных веществ (ПАВ) — мицеллообразователей. Чаще всего используют анионные ПАВ (например, додецилсульфат натрия — ДДСН, англ. SDS) в концентрациях, превышающих критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ), которая, например, для ДДСН в водном растворе составляет 8 мМ. В этом случае в растворе электролита находятся преимущественно мицеллы и небольшая доля мономерной формы ПАВ. Мономеры состоят из гидрофобного ╚хвоста╩ и гидрофильной (в случае анионного поверхностно-активного вещества отрицательно заряженной) ╚головы╩. При формировании прямых мицелл мономерные фрагменты агрегируются неполярными концами внутрь, а внешняя сферическая поверхность мицеллы становится отрицательно заряженной. Каждая мицелла окружена собственным двойным электрическим слоем, внешнюю диффузную часть которого формируют катионы, присутствующие в растворе ведущего электролита. Число мономеров, образующих мицеллу, может колебаться от 60 до 100 молекул, однако общий заряд мицеллы существенно меньше из-за наличия в неподвижной части второго слоя ДЭС гидратированных катионов. Ни мицеллярная, ни мономерная форма АПАВ не взаимодействуют со стенкой кварцевого капилляра, но при подаче на капилляр высокого напряжения обе формы мигрируют к аноду, в то время как ЭОП направлен к катоду. Если в капилляр на анодной стороне ввести пробу, содержащую нейтральные и заряженные компоненты, то ЭОП будет переносить их к катоду, а навстречу будет двигаться поток отрицательно заряженных мицелл АПАВ. Нейтральные компоненты пробы могут распределяться между фазой раствора и мицеллярной фазой, причем константа этого распределения специфична для каждого сорта молекул пробы. В результате на выходе капилляра регистрируется электрофореграмма нейтральных компонентов, а также медленно мигрирующих анионов пробы. 28 Система капиллярного электрофореза ╚Капель╩ Глава 3. Аппаратура 29 Глава 3. Аппаратура 3.1. Общее устройство систем КЭ Минимальный состав системы, реализующей метод капиллярного электрофореза, должен включать следующие узлы: кварцевый капилляр, источник высокого напряжения, устройство ввода пробы, детектор и систему сбора, обработки и вывода информации ( рис. 5). Дополнительными устройствами в системах капиллярного электрофореза являются, например, автосемплер и блок жидкостного охлаждения капилляра, которые позволяют: ⌠ автоматизировать подачу образцов, ⌠ осуществить эффективный отвод тепла от капилляра. 3.2. Капилляры В системах капиллярного электрофореза используют, как правило, капилляры из высокочистого плавленого кварца, прозрачного в УФ-области спектра, с внешним полимерным, чаще полиимидным, защитным покрытием. В случае детектирования внутри капилляра (on-line) полиимидное покрытие в зоне детектирования снимают, оставляя для прохождения света зону чистого кварца. Внутренний диаметр капилляров может варьироваться от 20 до 100 мкм, но чаще всего используют 50 и 75 мкм. Внешний диаметр составляет 365 мкм, длина капилляров 20–100 см. Различают общую (L общ) и эффективную (L эфф) длину капилляра: в первом случае речь идет о полной длине капилляра от входного до выходного конца, а во втором — об участке от входного конца до зоны детектирования ( рис. 5). Доминирующее число разделений в КЭ ведут на непокрытых изнутри капиллярах, так называемых немодифицированных. Их подготовка к анализу начинается, как правило, с промывки раствором щелочи для обеспечения диссоциации силанольных групп кварца и возникновения ЭОП. Тем не менее, анализ соединений, способных адсорбироваться на стенках кварцевого капилляра (например, белки, красители), или необходимость обращения ЭОП требуют использования покрытых капилляров (ковалентные покрытия или динамические). Капилляр является сердцем системы КЭ, как хроматографическая колонка в ВЭЖХ. В принципе, кварцевый капилляр имеет неограниченный ресурс использования при соблюдении основных правил работы. Тем не менее, замена капилляра (или переход к другой геометрии или типу) возможна и представляет собой несложную процедуру. Важной характеристикой капилляра является состояние его концов, особенно в зоне ввода пробы: торцевой срез должен быть выполнен строго под углом 90╟ к боковым стенкам капилляра. В противном случае можно наблюдать пики с ╚хвостами╩ или невоспроизводимый ввод пробы. Анализ методом КЭ можно проводить только тогда, когда капилляр находится в кондиционном состоянии. С точки зрения анализа кондиционное состояние капилляра следует понимать так, что выполняемые последовательно анализы должны быть воспроизводимы как по временам миграции пиков, так и по площадям пиков. Мы говорили выше, что общая скорость электромиграции иона складывается из двух величин: скорости движения иона под действием электрического поля и скорости движения ЭОП. Первая зависит от природы иона, а вторая — от свойств диффузной части двойного электрического слоя в капилляре, мерой которой является -потенциал поверхности. Причиной нестабильности времен миграции может служить изменение диффузной части второй обкладки двойного электрического слоя. Различные примеси, которые могут находиться как в ведущем электролите, так и в растворах проб, сорбируясь на поверхности капилляра, уменьшают -потенциал и, как следствие, увеличивают времена миграции компонентов. Сорбция может быть обратимой или практически необратимой в зависимости от химической природы примесей и состава ведущего электролита. Одновременно изменение времени миграции пика изменяет и его площадь (площадь пика пропорциональна времени миграции: поздно мигрирующие компоненты перемещаются через зону детектирования медленнее). Рис. 5. Устройство системы капиллярного электрофореза. 30 Система капиллярного электрофореза ╚Капель╩ Глава 3. Аппаратура 31 При подготовке к работе капилляр обычно промывают раствором кислоты, водой и раствором щелочи. Цель первой операции заключается в удалении с поверхности примесей, в частности, многовалентных катионов, и первичном гидролизе силоксановых групп. Промывка водой способствует удалению кислоты и дальнейшему гидролизу поверхности. Наконец, щелочная промывка предназначена для удаления примесей, не реагирующих с кислотой, и максимальной диссоциации образовавшихся силанольных групп. Финишная промывка водой имеет целью удалить из капилляра щелочь. Для того чтобы теперь привести очищенную и подготовленную поверхность в равновесие с раствором ведущего электролита, капилляр промывают собственно раствором ведущего электролита. При правильно проведенном кондиционировании времена миграции контрольных или тестовых веществ остаются постоянными при последовательных вводах. Если времена миграции тестовых веществ уменьшаются, это свидетельствует о недостаточном времени кондиционирования. При анализе на поверхности кварца могут сорбироваться различные примеси: многовалентные катионы, склонные к образованию гидроксокомплексов, катионные поверхностно-активные вещества, вещества белковой природы, обладающие свойствами амфолитов, нефтепродукты, некоторые полимеры и т. п. Все они нарушают структуру диффузного слоя и уменьшают -потенциал, что приводит к уменьшению скорости ЭОП и к увеличению времени миграции анализируемых ионов. Часть сорбированных примесей удаляется с поверхности при промывке раствором ведущего электролита (если сорбция обратимая), и тогда, подбирая время промывки, удается при последовательных анализах сохранять постоянными времена миграции компонентов. Если же в пробах имеются примеси, сорбирующиеся практически необратимо, приходится периодически промывать капилляр растворами, которые способны удалить накопившиеся примеси. Состав этих растворов следует выбирать, сообразуясь с химическими свойствами сорбированных веществ, и далее снова кондиционировать капилляр относительно раствора ведущего электролита. Часто более эффективным средством борьбы с такими примесями является их предварительное удаление на этапе подготовки пробы к анализу. Наши более подробные рекомендации по подготовке капилляра к работе, проверке его кондиционного состояния, хранению, способах восстановления работоспособного состояния, замене изложены в главе 9 и в Приложениях Б и В. Как правило, переключение полярности происходит в ручном режиме, что сопровождается сменой высоковольтных блоков. Тем не менее, существуют приборы с автоматическим переключением полярности, что в ряде анализов позволяет добиться эффекта концентрирования пробы на этапе ее ввода (внутри капилляра), так называемое on-line концентрирование. Безопасность работы с высоким напряжением для человека и самой аппаратуры достигается автоматическим отключением напряжения при открывании крышки прибора или при достижении максимально допустимого тока нагрузки. Запись кривых тока и напряжения (или визуальный контроль за их значениями на дисплее прибора или мониторе компьютера) может указать на случайные нарушения во время анализа и быть полезной при поиске ошибки. 3.4. Ввод пробы Типичный объем вводимой пробы в капиллярном электрофорезе составляет 1–20 нл. Общепринято заполнять пробой не более 2 % объема капилляра с тем, чтобы изначально, до анализа, не создавать широкую зону компонентов и обеспечить достаточное время нахождения зоны пробы в капилляре для установления значимых различий в электрофоретических подвижностях. Непосредственно перед вводом пробы капилляр промывают рабочим буферным раствором, удаляя остатки пробы от предыдущего ввода. Различают три способа ввода пробы: ⌠ гидродинамический, ⌠ электрокинетический, ⌠ гидростатический. Первые два способа реализованы во всех коммерческих системах капиллярного электрофореза, гидростатический, напротив, не нашел широкого применения. Ввод пробы давлением (гидродинамический, пневматический) обеспечивается созданием разницы давлений между сосудом для пробы и выходным концом капилляра, при этом давление либо повышается в сосуде для пробы, либо снижается на конце капилляра. Первый вариант наиболее распространен в коммерческих системах КЭ, в том числе в приборах ╚Капель╩. Объем вводимой пробы зависит только от разницы давлений и времени ввода пробы, при временах ввода порядка нескольких секунд разность давлений лежит в области нескольких миллибар (1000 мбар 1 атм). Не зная точного значения объема введенной пробы, мы, тем не менее, всегда уверены в точности дозирования, поскольку все системы КЭ оперируют величиной произведения давления на время ввода. Гидродинамический способ ввода не нарушает состав пробы, что позволяет вводить пробу из одной пробирки несколько раз. Важно! Последовательность операций при гидродинамическом вводе: сначала на выходе погружают конец капилляра в рабочий буферный раствор, затем на входе — в пробу. Автоматически или в ручном режиме вводят пробу, после чего на входе заменяют пробу на рабочий буфер и переходят к анализу. 3.3. Источники высокого напряжения В первую очередь, источники напряжения должны обеспечивать регулируемую подачу напряжения в диапазоне от –25 до +25 кВ и при заданной величине напряжения поддерживать постоянство этого значения. Максимально допустимый ток в капилляре при этом не должен превышать 200 мкА. В целом, что касается величины тока в капилляре при анализе, ориентироваться можно на следующие данные: <50 мкА 50–75 мкА 75–100 мкА 100–125 мкА >125 мкА отлично хорошо нормально допустимо плохо 32 Система капиллярного электрофореза ╚Капель╩ Глава 3. Аппаратура 33 Электрокинетический ввод пробы. При этом способе ввод пробы осуществляется путем подачи высокого напряжения на электроды, когда на входе установлена пробирка с раствором пробы, а на выходе — с рабочим буфером. За счет возникающего при этом ЭОП компоненты пробы перемещаются в капилляр. Количество введенной пробы при этом способе зависит от величины приложенного напряжения, времени, в течение которого приложено напряжение, и подвижности компонентов пробы. Особенностью этого ввода пробы является то, что компоненты с большей подвижностью будут концентрироваться в капилляре по сравнению с малоподвижными ионами, которые в случае недостаточного времени ввода, вообще могут не попасть в капилляр. Т. е. по сравнению с гидродинамическим способом ввода мы имеем в большей или меньшей степени дифференциацию состава пробы в капилляре и в исходном растворе. Это означает, что электрокинетический способ ввода пробы подразумевает только однократный ввод образца из одной пробирки. Этот способ ввода пробы наименее воспроизводим. Гидростатический ввод пробы. В этом способе для ввода пробы используют разницу в высоте между буферным сосудом и сосудом для проб. Гидростатическое давление способно создать поток жидкости в капилляре (╚сифонный╩ эффект) и, следовательно, ввести пробу в капилляр. Вводимое количество пробы зависит от разницы в высоте (обычно 5–10 см), времени (5–45 с.) и гидродинамических свойств раствора электролита и пробы (вязкость, плотность). Попутно отметим, что гидростатическое давление может послужить причиной невоспроизводимости времен миграции, если во время анализа уровни буферного раствора во входной и выходной пробирках окажутся разными. Поэтому необходимо обращать внимание на правильное заполнение пробирок раствором ведущего электролита перед анализом (равными порциями, например по 500 мкл), своевременное их перезаполнение (через 5–7 анализов), а также следует тщательно выверять установку прибора на горизонтальной плоскости. Примечание. Используя тот или иной способ ввода пробы, следует иметь в виду объемную и концентрационную перегрузку капилляра, которые оказывают влияние на уширение зон компонентов в ходе анализа и, следовательно, снижают эффективность разделения. Объемная перегрузка возникает при слишком большом времени ввода, а концентрационная — при вводе растворов с высокой концентрацией анализируемых компонентов. Таблица 2. Некоторые характеристики методов детектирования, применяемых в КЭ. ПриКачестмерный Примерный Детективенная предел детек- процент Универинфор- рование в испольтирования, сальность мация о капилляре зования, моль/л веществе % – +* + 10-5–10-7 55 Детектирование Селективность фотометрическое в УФ-В области спектра (прямое) фотометрическое в УФ-В области спектра (косвенное) флуориметрическое (прямое) флуориметрическое (косвенное) флуориметрическое (индуцированное лазером) массспектрометрическое амперометрическое (прямое) амперометрическое (косвенное) кондуктометрическое рефрактометрическое радиометрическое * диодная матрица + – + – + 10-4–10-6 5 + – – + – – + + 10-7–10-9 10-6–10-8 15 2 + – – + 10-13–10-16 5–7 + + – – – + + – + + + – + – – – – – – – – – + + 10-8–10-10 10-7–10-10 10-6–10-8 10 -7–10-9 10-6–10-8 10-10–10-12 10 2 <1 <1 <1 <1 3.5. Детекторы Некоторые характеристики методов детектирования, используемых в капиллярном электрофорезе, представлены в табл. 2. Указанные пределы детектирования позволяют оценить чувствительность того или иного детектора, при этом следует учитывать, что предел обнаружения определяется большим числом параметров, включая объем вводимой пробы, эффективность разделения, температурные эффекты, физико-химические свойства анализируемых веществ (молярный коэффициент поглощения, квантовый выход и т. п.) и другие. Детектирование в системах капиллярного электрофореза может осуществляться различными способами: ⌠ непосредственно в капилляре в части, близкой к выходному концу, в режиме реального времени (on-capillary). В зоне детектирования с внешней стенки капилляра снимают защитное полиимидное покрытие. Этот способ характерен для большинства коммерческих систем капиллярного электрофореза; ⌠ непосредственно на выходном конце капилляра (end-capillary); 34 ⌠ Система капиллярного электрофореза ╚Капель╩ Глава 3. Аппаратура 35 вне системы КЭ (off-capillary, при этом, как правило, детектор представляет собой отдельный самостоятельный прибор (например, масс-спектрометр) и соединен с системой капиллярного электрофореза специальным интерфейсом). В капиллярном электрофорезе используют те же принципы детектирования, что и в ВЭЖХ. Важным преимуществом КЭ перед ВЭЖХ, помимо плоского профиля ЭОП, о котором мы уже упоминали выше, является отсутствие соединительных гидравлических линий между узлами ввод пробы–капилляр и капилляр–детектор, которые в случае ВЭЖХ могут приводить к уширению зоны вещества за счет внеколоночного размывания. Основными принципами детектирования в КЭ являются: ⌠ фотометрическое в УФ-видимой области спектра (прямое и косвенное), ⌠ флуориметрическое (прямое и косвенное), ⌠ масс-спектрометрическое, ⌠ кондуктометрическое, ⌠ амперометрическое (прямое и косвенное), ⌠ радиометрическое, ⌠ рефрактометрическое. налы в ультрафиолетовой и видимой частях спектра (УФ-В-детекторы), обеспечивая запись в режиме сканирования. Данные, полученные одновременно на различных длинах волн (до 5), обрабатываются с помощью компьютеров, выделяющих сигнал на оптимальной длине волны и вычитающих фон. Применение детекторов на диодной матрице обеспечивает получение аналитических данных с гораздо большей степенью достоверности. Например, при определении гомогенности пика (однородности, peak purity) осуществляется спектральный контроль в максимуме и по обоим склонам пика. Если пик однороден, то все три спектра будут идентичны. Для данного вещества отношение высот пиков на электрофореграммах, записанных при двух различных длинах волн, есть величина постоянная. Гомогенность пика можно проверить также при сравнении параметров миграции анализируемого вещества, полученных при двух разных длинах волн (для ДМД обе электрофореграммы могут быть получены в ходе одного анализа). Идентификацию пика проводят путем сравнения времен миграции и спектров стандарта и компонента проанализированной пробы. Для соединений, анализируемых с помощью КЭ и не поглощающих в УФ-диапазоне, существует возможность регистрации методом косвенного УФ-детектирования. В этом случае в состав ведущего электролита вводят небольшое количество хромофора — вещества, поглощающего на требуемой длине волны. Так, в случае определения анионов поглощающий ион тоже должен быть анионом, например, хромат-ион, фталат-ион, а при определении катионов чаще всего используют катионы ароматических аминов или гетероциклов, в частности, ион протонированного бензимидазола. Так как ионная сила ведущего электролита в процессе разделения остается постоянной, в зоне, где находится непоглощающий ион, уменьшается концентрация поглощающего иона. Обмен происходит строго эквивалентно, на электрофореграмме наблюдаются обратные (отрицательные) пики, площади которых пропорциональны концентрациям определяемых ионов. Косвенное УФ-детектирование является универсальным вариантом детектирования, т. к. позволяет регистрировать все присутствующие в анализируемом растворе компоненты. Мы остановимся только на тех, которые реализованы в системах капиллярного электрофореза ╚Капель╩. Наиболее распространенным вариантом детектирования продолжает оставаться фотометрическое, основанное на поглощении веществом УФ или видимого света. Фотометрические детекторы в КЭ, как и в ВЭЖХ, подразделяют на: Детекторы с фиксированной длиной волны: источники света с линейчатым спектром (ртутная лампа (254 нм), кадмиевая лампа (229 нм) и цинковая лампа (214 нм). Это наиболее простые и недорогие системы; в приборах ╚Капель-103, -104╩ фотометрический детектор работает на длине волны 254 нм (строго 253,7 нм), поэтому отклик детектора будет наблюдаться только в том случае, если определяемый компонент имеет заметное поглощение на указанной длине волны. Этот случай называется прямым детектированием, электрофореграмма представляет собой набор положительных пиков, возвышающихся над базовой линией. Круг определяемых веществ достаточно широк и включает органические соединения с ароматической структурой, соединения с сопряженными двойными связями, некоторые неорганические соединения и др. Детекторы с изменяемой длиной волны: источниками света служат дейтериевые и вольфрамовые лампы (рабочий диапазон длин волн 190–350 нм и 340–850 нм, соответственно). Необходимая спектральная селекция достигается применением монохроматоров или узкополосных светофильтров. Детекторы на диодной матрице (ДМД). В таких детекторах световой поток, прошедший через капилляр, разлагается в спектр с помощью высококачественного светосильного монохроматора, а матрица фотодиодов постоянно регистрирует сиг- 3.6. Системы сбора и обработки данных Для записи электрофоретических данных можно использовать: ⌠ самописец (аналоговый сигнал), ⌠ принтер (через LPT- или USB-порт, встроенный в прибор), ⌠ компьютер (через АЦП или встроенный в прибор RS 232 или USB-порт). Безусловно, первые два способа являются очень трудоемкими при обработке данных, кроме того, характеризуются большими погрешностями измерения площадей или высот пиков, и в настоящее время уже не используются. Все коммерческие приборы КЭ на сегодняшний день комплектуются собственными или заимствованными программными продуктами, позволяющими записывать данные, проводить их качественную и количественную обработку, формировать отчеты. Некоторые из этих программ способны также управлять системами капиллярного электрофореза. 36 Система капиллярного электрофореза ╚Капель╩ Глава 4. Эффективность, чувствительность, разрешение и селективность в капиллярном электрофорезе 37 3.7. Автосемплеры После загрузки в автосемплеры образцов пробы, рабочих буферов и вспомогательных растворов можно проводить измерения в автоматическом режиме по заданным программам. В коммерческих системах автосемплеры реализованы в самых различных видах: единый блок с большим количеством разных или одинаковых по объему ячеек или отдельные автосемплеры для входного и выходного узлов прибора. Глава 4. Эффективность, чувствительность, разрешение и селективность в капиллярном электрофорезе Капиллярный электрофорез относится к группе комбинированных методов анализа, в которых объединены два основных процесса: предварительное разделение компонентов сложной смеси и их определение/детектирование. Важными характеристиками разделения являются разрешение, эффективность и селективность. Для конечного определения наиболее актуален параметр чувствительности, в первую очередь зависящий от типа используемого детектора. В этой главе будут рассмотрены основные факторы, влияющие на разделение, и пути повышения чувствительности определения. 3.8. Системы термостабилизации Термостатирование служит, главным образом, для отведения Джоулева тепла. Самым простым вариантом охлаждения капилляра является сильный обдув комнатным воздухом. Кроме того, используют воздушные и жидкостные системы термостатирования капилляров, температура при этом может варьироваться от +4 до +70 ╟С и поддерживаться постоянной на уровне 0,1 ╟С. В коммерческих приборах, как правило, термостатируют только капилляры (или их часть), а в сосуде для буфера не всегда поддерживается такая же температура, как в капилляре. В ряде приборов имеется возможность термостатировать автозагрузчик пробы, что особенно полезно при анализе термолабильных образцов. 4.1. Эффективность разделения Метод капиллярного электрофореза характеризуется высокой эффективностью. Эффективность N, выраженная числом теоретических тарелок, может быть определена непосредственно из электрофореграммы по уравнению (1): t N = 5,54 x w m 1/2 где t м — время миграции аналита, w1/2 — ширина пика на половине высоты. ( ) 2 (1) Какие же факторы оказывают влияние на эффективность разделения в капиллярном электрофорезе? Основными причинами, приводящими к снижению N, являются: величина зоны вводимой пробы, определяемая длительностью ввода: в идеале она должна быть как можно меньше, однако, достижение низких пределов обнаружения требует увеличения объема пробы или ее концентрирования; температурный градиент, при наложении электрического поля в капилляре, заполненном буфером, протекает электрический ток, величина которого зависит от удельной проводимости буфера и диаметра капилляра. Отвод тепла происходит через стенки капилляра, что приводит к возникновению в буфере радиального температурного градиента. Разница в температуре между серединой и стенками капилляра возрастает пропорционально квадрату диаметра капилляра. Температура в центре капилляра может быть на 10 ╟С выше, чем на внутренней стенке. Возникающий вследствие этого градиент вязкости приводит к тому, что вещество у стенки перемещается медленнее, чем в центре, что влечет за собой уширение полос и снижение эффективности; адсорбция на стенках капилляра; взаимодействие веществ со стенками капилляра, ведущее к искажению формы пиков (появление ╚хвостов╩); 38 Система капиллярного электрофореза ╚Капель╩ Глава 4. Эффективность, чувствительность, разрешение и селективность в капиллярном электрофорезе 39 различия в электропроводности пробы и ведущего электролита: уширение пика, обусловленное электрофоретическими эффектами, пропорционально проводимости (и, таким образом, ионной силе) раствора образца относительно буфера. В случае высокой концентрации пробы сила электрического поля (и, следовательно, линейные скорости) в зоне образца много ниже, чем в ведущем электролите. Благодаря этому происходит разбавление образца (дестэкинг) — уширение. Обратная ситуация в соотношении проводимостей (стэкинг), наоборот, приводит к формированию узких пиков на электрофореграмме; наличие гидродинамического потока из-за различия в уровне жидкостей (незначительная разность между уровнями буферов во входном и выходном сосудах приводит к возникновению гидродинамического потока с параболическим профилем; чем больше диаметр капилляра, тем значительней это сказывается на эффективности разделения). Всеми этими параметрами можно управлять, создавая оптимальные схемы разделения. Примечание. Такой фактор как продольная диффузия в капиллярном электрофорезе практически не привносит вклад в уширение зоны вещества, что обусловлено, в первую очередь, плоским профилем ЭОП. фазой (мицеллой), которая проникает в зону образца, где псевдостационарная фаза отсутствует. При этом (в отличие от стэкинга) проводимость раствора образца близка проводимости ведущего электролита. В ряде случаев свипинг позволяет получать 100-кратные концентрирования (on-line) без использования стадии предварительного концентрирования пробы. Чувствительность метода КЭ с УФ-детектированием может быть повышена за счет увеличения длины оптического пути при использовании капилляров с расширенным световым путем. Предложено несколько способов: зону детектирования выполняют в форме пузырька (bubble cell ), используют капилляры Z-формы (Z-shapped capillaries). Увеличение внутреннего диаметра капилляра в зоне детектирования позволяет вырасти сигналу в 3–5 раз, применение Z-ячейки позволяет увеличить чувствительность в 20–40 раз. Увеличению чувствительности определения способствует также снижение уровня шума детектора. На этом пути разработчики фирмы ╚Люмэкс╩ добились ощутимых результатов в деле стабилизации светового потока ламп и адекватного учета флуктуаций интенсивности потоков в каналах фотометра. 4.3. Разрешение и селективность разделения Конечной целью любого сепарационного метода является полное или частичное разделение компонентов пробы, характеризующееся параметром R s (разрешение). Чаще всего в капиллярном электрофорезе разрешение двух компонентов определяют так же, как в ВЭЖХ: 4.2. Чувствительность метода Основным способом детектирования в капиллярном электрофорезе является фотометрический, чувствительность которого не всегда достаточна, поскольку: ⌠ детектирование происходит в слое малой толщины (что обусловлено внутренним диаметром капилляра); ⌠ вводят очень малые объемы пробы. Подходы к увеличению чувствительности можно разделить на 3 категории: ⌠ стратегия концентрирования образца; ⌠ увеличение длины оптического пути; ⌠ использование высокочувствительных селективных детекторов. Стэкинг (stacking) — один из наиболее общих подходов к увеличению концентрационной чувствительности в КЭ. Стэкинг образца происходит, когда ионы аналитов пересекают границу, которая отделяет зону низкой проводимости раствора образца и высокой — ведущего электролита. В случае если матрица образца имеет значительно более низкую проводимость (обычно за счет разбавления буфером или водой), чем ведущий электролит, в зоне образца возникает относительно высокое электрическое поле. Аналиты внутри зоны образца движутся с более высокой локальной скоростью, и, замедляясь на границе с зоной ведущего электролита концентрируются. Стэкинг образца применителен только к заряженным аналитам. Свипинг (sweeping) — техника концентрирования нейтральных частиц в МЭКХ, суть которой заключается в том, что аналиты концентрируются псевдостационарной R s= 2 x (t1 – t2) w1 + w2 (2) где t1 и t2 — времена миграции первого и второго компонента, мин.; w1 и w2 — ширина пиков 1 и 2 при основании, мин. Разрешение в КЭ, в первую очередь, управляет эффективностью, а не селективностью. В этом заключается важное отличие КЭ от ВЭЖХ, где картина прямо противоположная. Благодаря узким зонам компонентов в капиллярном электрофорезе даже очень малые различия в электрофоретической подвижности веществ (в некоторых случаях <0,05 %) оказываются достаточны для полного разделения. Если выразить R s через эффективность: R s= 1 где 4 x N x ( ) (3) 40 Система капиллярного электрофореза ╚Капель╩ Глава 4. Эффективность, чувствительность, разрешение и селективность в капиллярном электрофорезе 41 то становится очевидным, что в противоположность эффективности, линейно возрастающей при увеличении рабочего напряжения, разрешение будет расти не так заметно. Существующее многообразие вариантов капиллярного электрофореза обеспечивает различную селективность разделения вследствие отличающихся механизмов разделения. Так, в зонном варианте КЭ при разделении компонентов 1 и 2 фактор селективности ( ) определяется выражением: Таблица 3. Факторы, определяющие параметры разделения в капиллярном электрофорезе. Параметры, влияющие на селективность рН ведущего электролита ионная сила ведущего электролита Характер влияния изменение формы нахождения вещества (заряда), скорости ЭОП изменение скорости ЭОП изменение скорости ЭОП скорость и направление ЭОП и электромиграции ионов, градиент температуры в капилляре (4) где 1 — электрофоретическая подвижность компонента 1, — электрофоретическая подвижность компонента 2. 2 вязкость буфера напряжение, кВ селективное концентрирование при вводе пробы, способ ввода пробы (гидродинамический, объемная и концентрационная перегрузка электрокинетический) и его параметры системы разделения геометрические характеристики кварцевого капилляра температура добавки в ведущий электролит (их природа и концентрация), смешанные добавки: ⌠ При концентрации ПАВ в растворе электролита больше ККМ реализуется вариант мицеллярной электрокинетической хроматографии с главным принципом разделения на основе распределения компонентов пробы между гидрофильной (водной) и гидрофобной (мицеллярной) фазами, селективность которого будет определяться отношением факторов емкости двух компонентов: = k'2 / k'1. В свою очередь, k' в режиме МЭКХ можно найти по уравнению (5): изменение времени нахождения зоны вещества в капилляре и скорости ЭОП градиент температуры вязкость электролита химические равновесия, сольватация комплексообразование, распределение аналитов между ╚фазами╩, образование ионных пар, сольватация ⌠ ⌠ ⌠ k' = t0 x ( t a – t0 t 1– a tm ) (5) ПАВ мицеллообразование при концентрации >ККМ ион-парные взаимодействия модификация ЭОП изменение скорости ЭОП (чаще снижение) сольватация образование комплексов включения растворимость гидрофобных компонентов хиральное распознавание где ta — время удерживания анализируемого вещества, t0 — время удерживания компонента, абсолютно не удерживаемого мицеллой, t m — время удерживания компонента, полностью удерживаемого мицеллой. ⌠ органические растворители макроциклы ⌠ ⌠ ⌠ ⌠ ⌠ ⌠ Для нахождения t0 и tm в пробу вводят маркер ЭОП (ацетон) и метку мицелл (судан 3 или судан 4), соответственно. Несмотря на высокую эффективность, достигаемую в капиллярном электрофорезе, селективность разделения, особенно в зонном варианте может быть недостаточна, в первую очередь, из-за осуществления процесса разделения внутри одной фазы. Задача повышения селективности разделения в том или ином варианте КЭ требует знания факторов, ее определяющих, и может быть решена за счет изменения рН ведущего электролита, введения в состав буфера различных добавок, например, ПАВ, макроциклов, органических растворителей (более полная информация о добавках представлена в табл. 3). Следует иметь в виду, что все эти факторы будут сказываться также на скорости ЭОП, однако, сам по себе электроосмотический поток не ответственен за изменение селективности разделения и определяет лишь изменение времени миграции (на равную величину для всех компонентов пробы). Выбор ведущего электролита является чрезвычайно важной задачей для успешного разделения в любом варианте КЭ. Величина рН ведущего электролита определяет как скорость течения жидкости в капилляре (величину ЭОП), так и форму нахождения компонента в растворе (заряд). Чувствительность ЭОП к изменению рН раствора заставляет использовать ведущие электролиты с высокой буферной емкостью, при этом диапазон рН, как правило, имеет значения рК а╠1. Благодаря высокой стабильности кварцевого капилляра при электрофоретическом разделении можно использовать буферные системы с рН от 2 до 12. В табл. 4 приведены наиболее распространенные электролиты. 42 Система капиллярного электрофореза ╚Капель╩ Глава 4. Эффективность, чувствительность, разрешение и селективность в капиллярном электрофорезе 43 Таблица 4. Наиболее распространенные буферные системы в КЗЭ. Буфер фосфатный ацетатный имидазольный фосфатный TRIS (триоксиметиламинометан) боратный CHES (2-[N-циклогексиламино]этансульфоновая кислота) рК а 2,12 (рК а1) 4,75 7,00 7,21 (рК а2) 8,30 9,24 9,50 Идеальный буфер для капиллярного электрофореза должен обладать следующими свойствами: ⌠ достаточная буферная емкость в выбранном диапазоне рН, ⌠ малое поглощение на длине волны детектирования, ⌠ низкая подвижность ведущего иона. Список так называемых ╚подходящих╩ буферов возглавляют боратный буфер и TRIS, так как они могут использоваться в широком диапазоне концентраций без существенного увеличения тока, что позволяет, в свою очередь, применять максимально высокие напряжения в ходе анализа. Среди используемых в капиллярном электрофорезе добавок наиболее популярны поверхностно-активные вещества. Их введение в состав буферных растворов позволяет в разной степени влиять на селективность, причем определяющими факторами являются тип ПАВ и его концентрация. В КЭ могут быть использованы как ионогенные (катионные (КПАВ) и анионные (АПАВ), а также цвиттер-ионные), так и нейтральные поверхностно-активные вещества. При концентрации ниже ККМ мономерные формы ионогенных ПАВ могут выступать как ион-парные добавки (различные АПАВ, КПАВ), а также влиять на растворимость гидрофобных компонентов смеси и модифицировать стенки капилляра (например, ЦТАБ). Возможные при этом механизмы взаимодействий поверхностноактивного вещества и пробы — ионные и/или гидрофобные. Добавки ПАВ в ведущий электролит влияют не только на поведение зоны пробы в капилляре, но и на стенки самого капилляра, модифицируя ЭОП (уменьшая, увеличивая или обращая). Органические растворители (метанол, ацетонитрил, изопропанол и др.), которые вводят в буферный раствор в концентрации от нескольких долей процента до 30 % (об.) могут, с одной стороны, повышать растворимость анализируемых соединений, делая капиллярный электрофорез пригодным для анализа веществ с ограниченной растворимостью в водных средах. C другой стороны, органические добавки могут уменьшать гидрофобные взаимодействия между анализируемым компонентом и мицеллой в МЭКХ, а также влиять на подвижность ЭОП и собственную электрофоретическую подвижность аналита. Макроциклические реагенты как компоненты ведущих электролитов широко распространены в КЭ. Макроциклическими называют циклические органические соединения, молекулы которых содержат не менее 9 атомов в цикле, причем не ме- нее 3 из них — гетероатомы. В качестве последних чаще всего выступают О, N и S. К макроциклическим соединениям относят циклодекстрины, краун-эфиры, криптанды, каликсарены и др. Все они способны взаимодействовать как с неорганическими веществами, так и с органическими субстратами различной природы, при этом происходит включение фрагментов анализируемых веществ в полость макроцикла (МЦ). В образующихся при этом комплексах включения по типу ╚гость–хозяин╩ ╚хозяином╩ служит макроцикл, а ╚гостем╩ — субстрат. В зависимости от своего строения МЦ могут связывать молекулярные, катионные или анионные субстраты. Движущей силой ассоциации макроцикла и субстрата могут быть нековалентные взаимодействия самых разных типов: ион-ионные, ион-дипольные, гидрофобные, водородные связи. Соотношение размеров полости МЦ и субстрата, конформация макроцикла и возможность ее изменения при комплексообразовании, а также природа и концентрация используемого макроцикла считаются важными факторами, влияющими на селективность разделения. Некоторые макроциклические реагенты (краун-эфиры, циклодекстрины и макроциклические антибиотики) могут выступать также в качестве хиральных селекторов. В капиллярном электрофорезе они являются составной частью ведущего электролита, и селективность разделения будет определяться типом и концентрацией макроцикла, а также добавками органических модификаторов, ПАВ и температурой. Использование макроциклических добавок как для хиральных, так и ахиральных разделений возможно в зонном и мицеллярном вариантах, причем селективность последнего будет выше за счет распределения компонентов смеси между тремя фазами: водной, псевдостационарной мицеллярной и псевдостационарной фазой макроцикла. 44 Система капиллярного электрофореза ╚Капель╩ Глава 5. Обработка результатов в капиллярном электрофорезе. Качественный и количественный анализ 45 Глава 5. Обработка результатов в капиллярном электрофорезе. Качественный и количественный анализ Целью любого анализа является получение ответов на вопросы: какие компоненты присутствуют в анализируемом образце и какова величина их концентраций? Первый из вопросов есть задача качественного анализа, второй — количественного. Для решения обеих задач в КЭ перед анализом пробы обязательно проводят процедуру градуировки системы путем измерения одной или нескольких смесей с известным качественным и количественным составом. Результатом градуировки являются формирование таблицы компонентов (содержит времена миграции и имена определяемых компонентов) и построение градуировочной зависимости (показывает зависимость сигнала детектора от концентрации/содержания вещества). В капиллярном электрофорезе используют те же принципы интегрирования пиков, методы градуировки, способы формирования отчетов, как в газовой хроматографии и ВЭЖХ. По аналогии с ВЭЖХ большинство детекторов в капиллярном электрофорезе являются концентрационными, для которых высота или площадь пика прямо пропорциональны концентрации вещества, образующего пик. Еще одним из вариантов повышения достоверности идентификации анализируемого компонента является введение в стандартный раствор и раствор пробы маркера — внутреннего стандарта. Это должно быть вещество, заведомо отсутствующее в анализируемых пробах, но имеющее схожие с определяемым веществом физикохимические свойства. Для стандарта и пробы вычисляют относительные времена миграции (можно арифметически поделить время миграции компонента на время миграции ЭОП и, наоборот, но для пробы и для стандарта это должно быть сделано одинаково) и находят в пробе близкие по численному значению результаты. Наиболее полную и достоверную идентификацию вещества на сегодняшний день можно получить при использовании диодно-матричного детектора, который по результату одного анализа может предоставить информацию: ⌠ по сопоставлению времени миграции вещества и его спектра в пробе и стандартном растворе (при этом дополнительно будет дана оценка чистоты пика пробы, например, по наложению спектров, снятых в трех точках пика: на обоих склонах и в максимуме); ⌠ по отношению откликов пика (например, площади) на двух разных длинах волн, полученных для стандарта и пробы. Для одного и того же вещества на двух разных длинах волн при неизменном времени миграции отношение площадей в стандартном растворе и растворе пробы должно быть постоянным. Длины волн выбирают так, чтобы компонент имел при этом разное поглощение, т. е. высота или площадь пика при двух разных длинах волн были бы различными. Примечание. Известно, что и площадь и высота пика определяются величиной введенной в капилляр пробы. В то же время площадь пика зависит от ЭОП и электрофоретической подвижности иона, которые влияют на его скорость. Чем медленнее движется ион по капилляру, тем шире в конечном итоге пик и больше его площадь. Для корректировки нестабильности скорости движения иона в предыдущем варианте идентификации можно рекомендовать сравнивать для двух разных длин волн отношения площади пика к его времени миграции. Принято также считать, что использование электрофоретической подвижности вместо времени миграции позволяет корректно идентифицировать компоненты сложных смесей. Мы уже упоминали, что в варианте МЭКХ по сравнению с капиллярным зонным электрофорезом из-за различий в принципе разделения качественную характеристику вещества называют временем удерживания, а не временем миграции. Однако для большей корректности в МЭКХ в качестве идентификационного параметра рекомендуют использовать фактор емкости k' (формула 5, с. 40). 5.1. Качественный анализ. Характеристики миграции/удерживания Качественный анализ обычно состоит в сравнении времен миграции (в случае капиллярного зонного электрофореза) или времен удерживания (в случае мицеллярной электрокинетической хроматографии), полученных для стандарта и пробы, измеренных в одинаковых условиях. Если эти времена совпадают с заданной точностью (обычно окно идентификации не превышает 5 %), то считают, что искомое вещество в пробе найдено и переходят к количественному анализу. Тем не менее, такой способ идентификации вещества не всегда надежен, особенно в случае анализа проб со сложной матрицей.

" Руководство по капиллярному электрофорезу ". Вложение: Руководство по каппилярному электрофорезу.pdf. У вас нет необходимых.

Подробная инструкция проведения процедур лекарственного электрофореза с препаратами серии Карипаин.